研究人員發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)往往與sgRNA有關(guān)。除了直接編輯靶向位點(diǎn)外，sgRNA還可能會(huì)容忍5到6個(gè)錯(cuò)配堿基，或因缺失或多出堿基導(dǎo)致非靶向切割。這些潛在的脫靶位點(diǎn)在基因組中有成千上萬，因此全面評(píng)估全基因組范圍內(nèi)的脫靶效應(yīng)成為了一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。
在此背景下，新葡萄8883官網(wǎng)AMG團(tuán)隊(duì)基于全基因組測序和生物信息學(xué)預(yù)測，開發(fā)了一個(gè)技術(shù)方案，用于分析基因組中由脫靶效應(yīng)引起的單核苷酸突變（SNV）、插入缺失變異（Indels）、拷貝數(shù)變異（CNV）和結(jié)構(gòu)變異（SV）。近年來，基因組測序已被廣泛用于檢測脫靶效應(yīng)。Kevin等人（2021）通過全基因組測序和生物信息學(xué)分析評(píng)估了Cas9的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。他們對(duì)163個(gè)sgRNA在基因編輯小鼠與對(duì)照小鼠中的基因組序列和結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行了比較，并利用Cas-OFFinder預(yù)測了這些sgRNA在基因組中的556266個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)。通過分析變異信息與潛在脫靶位點(diǎn)的交集，他們檢測到28個(gè)脫靶位點(diǎn)，其中9個(gè)通過Sanger測序驗(yàn)證為真實(shí)脫靶位點(diǎn)。這表明盡管真正的脫靶效應(yīng)僅占潛在脫靶的一小部分，但相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)仍不容忽視。
基于基因編輯的脫靶特性，新葡萄8883官網(wǎng)AMG研發(fā)團(tuán)隊(duì)結(jié)合基因組測序推出了全基因組脫靶檢測服務(wù)。我們采用mutect2作為變異分析工具，通過比對(duì)基因編輯組和對(duì)照組的測序數(shù)據(jù)，鑒定出基因編輯組中的SNV和Indels變異。此外，我們還使用Cas-OFFinder來預(yù)測潛在脫靶位點(diǎn)，該工具能夠分析sgRNA與基因組之間的匹配情況。通過將mutect2的變異分析結(jié)果與Cas-OFFinder的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行交集分析，可以準(zhǔn)確確定編輯后的脫靶位點(diǎn)。
除了對(duì)脫靶效應(yīng)的分析，新葡萄8883官網(wǎng)AMG還使用CNVkit和manta兩種生物信息學(xué)分析工具來進(jìn)行更深入的研究。CNVkit可識(shí)別基因組中的拷貝數(shù)變化，而manta則能夠檢測插入、缺失及易位等染色體結(jié)構(gòu)變異類型。這些結(jié)果有助于全面了解基因編輯導(dǎo)致的染色體結(jié)構(gòu)變異。
與傳統(tǒng)的GUIDE-seq體內(nèi)檢測相比，全基因組脫靶檢測不依賴于寡核苷酸（ODN）插入，這提供了一種更加靈活且便捷的檢測方法。同時(shí)，它還能夠分析染色體的大面積變異，幫助科研人員全面評(píng)估基因編輯的效果和潛在風(fēng)險(xiǎn)。作為國內(nèi)首家提供脫靶檢測服務(wù)的公司，新葡萄8883官網(wǎng)AMG可提供全基因組脫靶檢測、GUIDE-seq體內(nèi)脫靶檢測、AID-seq體內(nèi)脫靶檢測等多種專業(yè)服務(wù)。如有需求，歡迎隨時(shí)咨詢。
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