Cre-LoxP系統(tǒng)是一種基于位點特異性重組的基因編輯技術(shù)，由Cre重組酶和LoxP位點組合而成。Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一種由噬菌體P1產(chǎn)生的DNA重組酶，分子量為38kDa，由343個氨基酸構(gòu)成。Cre能特異性識別LoxP位點的DNA序列，并介導LoxP位點之間的DNA重組。
LoxP位點是一種34bp的序列，包含兩個13bp的反向回文序列和一個8bp的中間序列。反向回文序列是Cre重組酶的結(jié)合位點，而中間序列則決定了LoxP的特異性。Cre-LoxP系統(tǒng)的主要優(yōu)勢在于其高效性和特異性，能夠?qū)铙w動物實現(xiàn)精確的基因敲除、插入和翻轉(zhuǎn)等操作。自20世紀80年代末被首次描述以來，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于基因功能研究、疾病模型構(gòu)建及神經(jīng)科學研究等領(lǐng)域。
當基因中存在LoxP位點且有Cre重組酶時，Cre重組酶會識別LoxP位點的反向重復序列并結(jié)合形成二聚體。這些二聚體與其他LoxP位點的二聚體結(jié)合，形成四聚體，隨后Cre重組酶切割LoxP位點之間的DNA序列，導致DNA斷裂。通過DNA連接酶的作用，這些斷裂的DNA端再次連接，從而完成重組過程。根據(jù)LoxP位點的方向和位置，Cre酶可以進行以下幾種基因操作：
- 刪除：當兩個LoxP位點在同一DNA片段的兩端且方向相同時，Cre酶可以切除這兩個LoxP位點之間的DNA片段。
- 翻轉(zhuǎn)：當兩個LoxP位點在同一DNA片段的兩端且方向相反時，Cre酶可以介導序列翻轉(zhuǎn)。
- 易位：若兩個LoxP位點位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶會誘導發(fā)生易位。
- 交換：如果四個LoxP位點位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶可誘導LoxP間的序列互換。
自Cre-LoxP系統(tǒng)問世以來，科學家們進行了多種優(yōu)化，開發(fā)了LoxP位點的突變版本，如Lox2272、Lox511、Lox5171及LoxN等。這些變體表現(xiàn)出更高的識別和切割效率，能夠在不同生物體中實現(xiàn)更復雜的基因重組。
LSL（LoxP-Stop-LoxP）系統(tǒng)是基于Cre-LoxP系統(tǒng)的一種條件性基因表達工具。它在目標基因上游插入被LoxP位點包圍的終止盒。當Cre重組酶存在時，LoxP位點之間的DNA序列被切除，解除對目標基因的轉(zhuǎn)錄阻斷，從而實現(xiàn)特定啟動子驅(qū)動下的基因表達。
FLEX（Flip-Excision）系統(tǒng)通過在目標基因兩側(cè)設(shè)計不同方向或類型的LoxP位點，使Cre重組酶能先翻轉(zhuǎn)基因片段方向，再切除特定序列，實現(xiàn)基因表達的雙向調(diào)控。
DIO（Double-Floxed Inverted Orientation）系統(tǒng)是基于FLEX系統(tǒng)的優(yōu)化版本。在DIO系統(tǒng)中，目標基因的開放閱讀框反向排列并被LoxP和Lox2272位點包圍。Cre重組酶的作用使得目標基因翻轉(zhuǎn)，激活基因表達。
在DO（Double-Floxed Orientation）系統(tǒng)中，目標基因的開放閱讀框正向排列，被LoxP和Lox2272位點包圍。Cre重組酶的作用會翻轉(zhuǎn)目標基因，使其與啟動子方向不一致，從而抑制基因表達。由于LoxP和Lox2272位點互不兼容，重組后的基因無法再次翻轉(zhuǎn)，實現(xiàn)穩(wěn)定的基因抑制。
在轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中，利用Cre-LoxP系統(tǒng)的實現(xiàn)特定基因的敲除，取得了顯著的實驗成果。例如，研究人員在小鼠的特定外顯子兩側(cè)插入同向的LoxP位點，通過病毒注射實現(xiàn)單側(cè)特定基因的敲除。
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